产品目录

本试剂盒用于扩增大于或等于5kb的片段。试剂盒中最重要的组分是Long Polymerase，由Taq DNA酶和具有校对活性的热稳定DNA聚合酶组合而成。这种酶的主要特点包括两方面，一个是使用人类基因组DNA模板时产物可达20kb，使用病毒基因组模板时产物可达40kb；另一个是比Taq DNA聚合酶保真性高。Long PCR Buffer可保护DNA在长期热循环中免受损伤。

• 模板DNA
  在50μL反应体系中使用1～10ng的质粒或噬菌体DNA，或0.1～1μg的基因组DNA。高质量和完整的模板DNA是长
  片段PCR扩增的关键。损伤的DNA可能会得不到目的PCR产物。基因组DNA可通过磁珠法DNA提取试剂盒获得，无需
  离心过程。另外，请将模板DNA分装成小分存储，避免反复冻融。降解的模板DNA不适合用来扩增长的目的片度。
  
• 引物浓度
  在一次PCR中引物的终浓度大约为0.1～0.5μM。PCR产物小于或等于10kb时，引物的终浓度为0.1μM。长片段的引
  物设计原则和普通引物设计原则相似。主要不同在于引物应为28～35个核苷酸的长度。
  
• 冰上溶解各组分并短暂离心。
  
• 根据以下实验方案准备反应体系：
  

  成分	用量
  10×Long PCR Buffer	5μL
  10mM dNTP Mix	1μL
  Forward primer	0.1～0.5μM
  Reverse primer	0.1～0.5μM
  Template DNA	1ng～1μg
  Long Polymerase	1.25～2.5U
  Sterilized ddH2O	至50μL

  
  注意：
  ① 如果PCR产物GC含量高，请加入2μL DMSO到50μL PCR反应体系中；
  ② 如果PCR产物大于20kb，dNTP Mix终浓度是0.3mM；
  ③ 请在最后加入Long Polymerase并直接开始PCR。
  ④ PCR产物小于等于15kb，则50μL使用1.25U Long Polymerase；PCR产物大于>15kb，每50μL使用量最多为2.5U。
  
• 将反应管放入离心机，离心30-60 s；
  
• 若使用的热循环仪无热盖功能，则用矿物油将PCR混合液覆盖。
  
• 样品放入PCR仪中，并根据以下循环程序直接开始PCR。
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	94℃	2min	1
  变性	94℃	20 s	10
  退火	Tm-5℃	30 s
  延伸	68℃	1min/kb
  变性	94℃	20 s	20~25
  退火	Tm-5℃	30 s
  延伸	68℃	1min/kb+X s/cycle
  终延伸	68℃	10min	1
  保存	4℃	N.A.	N.A.

  
  根据下表计算延伸时间：
  

  PCR片段长度(kb)	10	15	20	25	30	35	40
  延伸时间(min)	8	15	20	20	23	25	27
  每个循环需要增加的时间 (X s/cycle)	5	5	10	10	15	15	20

• 扩增Enterobacteriaλ噬菌体基因组DNA区域(20kb)
  
• 根据以下实验方案准备反应体系：
  

  成分	用量
  10×Long PCR Buffer	5μL
  dNTP Mix (10mM)	1μL
  Lambda 20kF (10μM)	0.5μL
  Lambda 20kR (10μM)	0.5μL
  Lambda DNA (2ng/μl)	0.5μL
  Long Polymerase	0.25μL
  Sterilized ddH2O	至50μL

• 将反应管放入离心机并离心30～60s。
  
• 将样品放入循环仪中并根据下列循环程序直接开始PCR。
  

  步骤	温度	时间	循环次数
  Initial Denaturation	94℃	2min	1
  Denaturation	94℃	20 s	10
  Annealing	63℃	30 s
  Extension	68℃	20min
  Denaturation	94℃	20 s	20
  Annealing	63℃	30 s
  Extension	68℃	20min+10 s/cycle
  Final Extension	68℃	10min	1
  Hold	4℃	N.A.	N.A.

• PCR产物通过0.5%琼脂糖凝胶电泳显示(图1)
  
  图1．20kb PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

• 产物少或没有
  
  • 模板DNA不足
    根据标准操作步骤提高PCR中模板DNA的含量。
    
  • 模板质量差
    始终使用纯化、完整的高质量DNA作为模板。用琼脂糖凝胶电泳分析模板的完整性。将模板DNA分装储存，避免反复冻融。
    
  • 困难模板
    如果模板DNA的GC含量高，反应体系中加入4% DMSO将有助于反应。此外，每50μL PCR反应体系中建议使用高达2.5U的酶浓度。
    
  • 热循环相关问题
    检查是否正确设置了热循环程序，以5个循环数为增量提高循环次数。
    
  • 引物浓度过低
    使用引物终浓度为0.1～0.5μM。
    
  • Mg²⁺浓度不是最优
    优化并调整Mg²⁺浓度。
• 产物多条带
  
  • 引物设计不完善
    检查引物设计及其特异性。
    
  • 引物降解
    检查引物溶液浓度和质量。
    
  • 退火温度过低
    提高退火温度。进行梯度PCR，找到最优的退火温度。
    
  • 循环数太多
    减少循环次数以排除非特异性产物。
    
  • 模板太多
    
    • 扩增病毒或质粒DNA时，每50μL PCR体系的初始模板浓度不应超过10ng；
      
    • 扩增基因组DNA时，每50μL PCR体系的初始模板浓度不应超过1μg。
• 产物被污染
  
  • 起始模板太多
    减少模板DNA的量。
    
  • 循环数太多
    以5个循环数为增量减少循环次数
    
  • 延伸时间过长
    以2分钟为增量减少延伸时间
    
  • Mg²⁺浓度不是最优
    优化并调整Mg²⁺浓度
    
  • 酶过量
    确保每50μL PCR体系中加入的酶含量等于或少于2.5U。
    
  • 携带污染
    纯化DNA模板。使用尿嘧啶DNA糖基化酶以防止携带污染。